優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，那么你知道ELISA實驗的操作要點有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、標(biāo)本的采取和保存

可用作 ELISA 測定的標(biāo)本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分 ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血kuai收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標(biāo)本。在 ELISA 中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法 ELISA 中可使本底加深。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。

二、試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用 pH 計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。

三、加樣

在 ELISA 中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法 ELISA)需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩 1 分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。

四、保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在 ELISA中似不恰當(dāng)。ELISA 屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和 4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立 ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在 37℃經(jīng) 1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達ding峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在 43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng) 4℃更為徹di，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在 ELISA 中一般不予采用。

五、洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。

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