檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞的生理活性是掌握生物體骨代謝狀態(tài)的有效方法。骨組織使用堿性磷酸酶（ALP）進(jìn)行染色可明確成骨細(xì)胞的成骨潛能，使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色可明確破骨細(xì)胞的骨吸收能力。并且在同一切片上進(jìn)行二重染色時(shí)，可同時(shí)識(shí)別二者

       正常的骨代謝是通過成骨細(xì)胞生長與破骨細(xì)胞建立骨吸收而維持平衡。成骨細(xì)胞的標(biāo)記酶是堿性磷酸酶（ALP）。破骨細(xì)胞的標(biāo)記酶是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）。這兩種標(biāo)記酶在組織切片或者培養(yǎng)細(xì)胞過程中，被作為成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞存在的標(biāo)記指標(biāo)。

       TRAP/ALP破骨成骨雙重染色試劑盒可通過骨組織切片以及培養(yǎng)細(xì)胞中TRAP/ALP酶活性進(jìn)行組織染色。通過觀察成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的染色成像，可檢查細(xì)胞的分化狀態(tài)和骨組織的分布情況。

一、特點(diǎn)：

使用時(shí)混合3種溶液，可制備TRAP酶活性染色的顯色底物溶液。

ALP酶活性染色使用的是預(yù)混物溶液，操作簡便。

TRAP的活性部位呈紅紫色，ALP的活性部位呈藍(lán)色（茶褐色），可雙重染色。適用于骨組織切片（脫鈣GMA樹脂包埋切片）以及培養(yǎng)細(xì)胞。

二、染色方法

染色法是Lorch的Gomori法。使用的是偶氮染料法和耦合法結(jié)合的TRAP/ALP染色試劑盒。Lorch推薦切片厚度為8μm，同時(shí)也研究了普通的4μm切片是否能染色、雙重染色的順序應(yīng)該先染TRAP和ALP中的哪一個(gè)、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問題。

染色法結(jié)果：偶氮染料法中切片過厚導(dǎo)致酶擴(kuò)散圖像。即用TRAP染色骨質(zhì)有紅染傾向，但即使是4μm厚度，只要增強(qiáng)反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間），也能充分染色的。換言之，TRAP染色中反應(yīng)溫度從室溫調(diào)至37℃，反應(yīng)時(shí)間從30分鐘調(diào)至45分鐘或60分鐘。ALP染色在37℃反應(yīng)45分鐘至3小時(shí)，或者室溫（10-15℃）下反應(yīng)時(shí)間增加至一晚。此結(jié)果顯示，兩者色調(diào)平衡，染色效果好。但是，反應(yīng)條件的增強(qiáng)導(dǎo)致ALP染色切片產(chǎn)生了很多色素顆粒。另外，TRAP和ALP的染色順序哪一個(gè)先染色都是可以的。如果先進(jìn)行ALP染色時(shí)，在TRAP陽性部位呈明顯的紅色，鮮艷處為破骨細(xì)胞。獲得比較好的標(biāo)本。但是，ALP的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過TRAP溶液處理后，會(huì)產(chǎn)生白色混濁顆粒，沉淀在組織上。因此，先TRAP染色，接著ALP染色的方法是可行的。封裝法是利用甲基綠數(shù)秒間核染色處理。水洗后，37℃下干燥，二甲苯浸透，用馬里醇(Marinol)永jiu封存。

脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色

用1年齡小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片，進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色。

TRAP陽性將破骨細(xì)胞染成紅色，ALP陽性將細(xì)胞活性強(qiáng)的細(xì)胞（成骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞）染成褐色。（上：弱擴(kuò)大，下：強(qiáng)擴(kuò)大）

TRAP和ALP的雙酶染色實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)固定、脫鈣、染色進(jìn)行多處改良，實(shí)現(xiàn)了對(duì)脫鈣石蠟標(biāo)本的染色。但是酶擴(kuò)散圖像對(duì)TRAP染色的效果ji佳。出于各種原因的考慮，關(guān)于固定步驟的影響，如果固定不充分的話，容易抑制脫鈣水平。進(jìn)而導(dǎo)致酶擴(kuò)散的發(fā)生。另外，注意脫鈣本身的影響也是有必要的。總而言之，和非脫鈣標(biāo)本相比較，脫鈣標(biāo)本的擴(kuò)散圖像更加明顯。脫鈣會(huì)使酶擴(kuò)散變強(qiáng)。

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