產(chǎn)品名稱：碧云天beyotime線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1071M)現(xiàn)貨供應(yīng)

產(chǎn)品貨號(hào)：C1071M

產(chǎn)品品牌：碧云天beyotime

使用方法：

1. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：

a. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過(guò)程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。

b. 取5-10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。

c. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。

d. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過(guò)程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。

e. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可立即上機(jī)檢測(cè)，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍(lán)色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時(shí)候流式檢測(cè)僅檢測(cè)紅色和綠色熒光即可，也可以同時(shí)檢測(cè)紅綠藍(lán)三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。

注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)；熒光探針的濃度可以根據(jù)具體的染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測(cè)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，都可以不加入Hoechst 33342染色液。

2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞的消化后檢測(cè)：

a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過(guò)度消化。

注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時(shí)間如果過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷；消化時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng)，同樣易造成細(xì)胞膜損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合從而干擾對(duì)于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。同時(shí)，胰酶細(xì)胞消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因?yàn)?/span>EDTA可能會(huì)影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。

b. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。

c. 取5-10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。

d. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。

e. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過(guò)程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。

f. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可立即上機(jī)檢測(cè)，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍(lán)色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時(shí)候流式檢測(cè)僅檢測(cè)紅色和綠色熒光即可，也可以同時(shí)檢測(cè)紅綠藍(lán)三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。

注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)；熒光探針的濃度可以根據(jù)具體的染色效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測(cè)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，都可以不加入Hoechst 33342染色液。

3. 對(duì)于貼壁細(xì)胞的原位熒光檢測(cè)：

注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測(cè)不到。

a. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對(duì)多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。

b. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。

c. 加入188µl Annexin V-FITC結(jié)合液。

d. 加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻。

e. 加入2µl Mito-Tracker Red CMXRos染色液和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。

f. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。

g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光，Annexin V-FITC為綠色熒光，Hoechst 33342為藍(lán)色熒光。

注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)。熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)，也可以不加入Hoechst 33342染色液。

相關(guān)文獻(xiàn)：

[1]Tingting Liu, Cheng Jiang, Liying Zhu, Ling Jiang, He Huang. Fe 3 O 4@chitosan Microspheres Coating as Cytoprotective Exoskeletons for the Enhanced Production of Butyric Acid With Clostridium tyrobutyricum Under Acid Stress Front Bioeng Biotechnol. 2020 May 15;8:449. doi: 10.3389/fbioe.2020.00449.

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