腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)

重組腺病毒載體是基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因組是 36kb 長(zhǎng)的線性雙鏈 DNA，是一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)。具有以下幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：感染范圍廣，幾乎可以感染所有的細(xì)胞系、原代細(xì)胞和部分組織；感染效率可高達(dá) 100%；對(duì)外源基因容載能力大（可以高達(dá) 8Kb）；不整合基因組；滴度高，操作方便。因此，重組腺病毒是一種最ju有潛力的基因遞送工具。

最chang用的腺病毒包裝體系有 AdEasy 和 AdMAX 兩種，其共同特點(diǎn)是目的基因首先克隆到穿梭載體，再重組到腺病毒的大骨架上。以上兩個(gè)系統(tǒng)均具有腺病毒早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），其中 E3 基因?qū)Σ《镜漠a(chǎn)生并非必需。因此，腺病毒包裝必需依賴(lài)表達(dá) E1 的細(xì)胞系，例如 HEK-293，HEK-293A 等。

一、實(shí)驗(yàn)流程

圖 1、 腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)流程圖

二、實(shí)驗(yàn)儀器與材料

表 1、腺病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒

三、實(shí)驗(yàn)步驟 

1. 質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增

AdMAX 系統(tǒng)：構(gòu)建連接目的基因的 pHBAdMAX質(zhì)粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre 質(zhì)粒并大量抽提，用于轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞。

AdEasy 系統(tǒng)：構(gòu)建連接目的基因的 pHBAdEasy 質(zhì)粒并進(jìn)行酶切線性化；線性化后轉(zhuǎn)入 BJ5183 感受態(tài)（含 pAdEasy-1 骨架質(zhì)粒）進(jìn)行重組，涂板培養(yǎng)單克隆并擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒進(jìn)行 PacI 酶切驗(yàn)證；驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Stbl3 感受態(tài)，得到高純度的重組質(zhì)粒并進(jìn)行 PacI 酶切線性化，用于轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞。

2. 腺病毒包裝

表 2、腺病毒包裝轉(zhuǎn)染體系

3. 腺病毒收集

挑取 3-6 個(gè)空斑不等，放入1 ml新鮮培養(yǎng)基中過(guò)夜，然后比較滴度，使用滴度最高的一個(gè)空斑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（注：病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成。為了限制病毒的擴(kuò)散而讓空斑更好地形成，可在培養(yǎng)液中加入低熔點(diǎn)瓊脂糖，一般在轉(zhuǎn)染后第 10 ~ 21 天可以在顯微鏡下看到小的空斑。）

4. 腺病毒擴(kuò)增

將培養(yǎng)基中的病毒加入新鮮 293A 細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行病毒少量擴(kuò)增，至再次出現(xiàn)空斑，收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次收集病毒（P1 代），感染 293A 細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行三代感染，至 P4 代進(jìn)行腺病毒的大量擴(kuò)增并收集病毒。

5. 腺病毒純化

將病毒從 -80 ℃ 冰箱取出，室溫水浴融化。在 4 ℃ 下，7000 g 離心 10 min，棄細(xì)胞碎片，收集上清，0.22 μm 過(guò)濾除菌即可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。若用于對(duì)腺病毒滴度和純度要求高的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，則需要采用 PEG8000 沉淀-CsCl 密度梯度離心-透析聯(lián)用法進(jìn)行純化。

6. 病毒重懸和保存

棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于 4 ℃ 保存，如需長(zhǎng)時(shí)間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。

四、注意事項(xiàng)

1. 腺病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)請(qǐng)?jiān)谏锇踩瘢?/span>BL-2 級(jí)別）內(nèi)操作。

2. 操作病毒時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴口罩和手套，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚。

3. 操作病毒時(shí)特別小心病毒濺出。如果操作時(shí)超凈工作臺(tái)有bing毒污染，請(qǐng)立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干凈。接觸過(guò)病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請(qǐng)用84消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。

4. 如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，如有必要請(qǐng)用封口膜封口后離心。

5. 動(dòng)物注射操作請(qǐng)?jiān)谏锇踩駜?nèi)（BL-2 級(jí)別）完成。

6. 病毒相關(guān)的廢棄物需要特殊收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。

7. 實(shí)驗(yàn)完畢用洗手液清洗雙手。

五、常見(jiàn)問(wèn)題

1. 腺病毒載體有幾代，需要怎樣選擇？

第一代腺病毒載體：E1/E3 基因缺失的腺病毒載體稱(chēng)為第一代腺病毒載體；

第二代腺病毒載體：E2A/E4 基因缺失的腺病毒載體被稱(chēng)為第二代腺病毒載體，產(chǎn)生的免疫原性較低，載體容量和安全性方面均提高，但病毒包裝難度和出毒滴度嚴(yán)重下降，應(yīng)用受限。

第三代腺病毒載體：第三代載體缺失了全部的或大部分腺病毒基因，僅保留了兩端 ITR 和包裝信號(hào)。包裝容量高達(dá) 35kb，免疫原性極低，載體中引入核基質(zhì)附著區(qū)基因用于外源基因長(zhǎng)期表達(dá)并增加了載體的穩(wěn)定性。但第三代載體系統(tǒng)需要腺病毒突變體作為輔助病毒。

目前，第一代腺病毒載體仍是科研和臨床應(yīng)用最為廣泛的腺病毒載體，因此更為推薦。

2. 腺病毒的兩種包裝系統(tǒng)怎么選擇？

需要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)以及需求進(jìn)行選擇。

（1）AdEasy 系統(tǒng)：操作步驟相對(duì)可控，AdEasy 系統(tǒng)得到的病毒滴度相對(duì)較高。AdEasy 系統(tǒng)是較常用的系統(tǒng)，在 BJ5183 感受態(tài)中完成環(huán)狀腺病毒基因組的重組，將重組腺病毒基因組經(jīng) Pac I 酶切線性化后轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞。但重組腺病毒基因組的陽(yáng)性率比較低，需要挑選大量的克隆進(jìn)行驗(yàn)證。

（2）AdMax 系統(tǒng)：是直接將穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒導(dǎo)入到包裝細(xì)胞 293A 中，重組過(guò)程不可控，中間無(wú)法進(jìn)行篩選，所以重組假陽(yáng)性較高，篩選陽(yáng)性結(jié)果的難度較 AdEasy 系統(tǒng)高很多。 但 AdMax 包裝系統(tǒng)流程更簡(jiǎn)便易操作，適合新手研究人員。

3. 腺病毒純化的目的是什么？

純化后的腺病毒可以去除缺損的病毒顆粒、細(xì)胞毒素、細(xì)胞培養(yǎng)基、以及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。純化腺病毒免疫原性較低，更適合做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

4. 腺病毒感染毒斑和細(xì)胞聚集怎么進(jìn)行區(qū)分？

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)類(lèi)似病毒空斑或者細(xì)胞聚集的現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng) 1-3 天，觀察聚集區(qū)域是否擴(kuò)散，若持續(xù)擴(kuò)散一般為病毒毒斑，若聚集區(qū)域保持不變，則一般為細(xì)胞聚集現(xiàn)象。